Hypertonus Saline Therapie bei zystischer …

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Hypertonus Saline Therapie bei zystischer ...

Hypertonus Saline-Therapie bei Mukoviszidose

abstrakt

Die Jüngsten Daten zeigen den Klinischen Nutzen von zerstäubten hypertonen Kochsalzlösung bei Mukoviszidose-Lungenerkrankungen, MIT Einems vorgeschlagenen Mechanismus Nachhaltige Steigerung der Atemwegsoberfläche Flüssigkeitsvolumen beteiligt. Um der paradoxe Beobachtung that Amilorid sterben wohltuende wirkung von hypertonischen Kochsalzlösung unterdrückt, Wurde zuvor abgeschlossen (Donaldson, S. H. Bennett, W. D. Zeman, K. L. Knowles, M. R. Tarran, R. und Boucher, R. C. (2006) N. Engl. J. Med. 354, 241-250), that Aquaporin (AQP) Wasserkanäle in Atemwegsepithelien modulieren Flüssigkeitsvolumen Atemwegsoberfläche Amilorid-sperrbaren. Hier Haben wir Wasserdurchlässigkeit und Amilorid Effekte in gut differenzierten, Primärkulturen von Menschlichen Epithelzellen der Atemwege charakterisiert, stabil transfizierte Fisher Ratten Schilddrüsen Epithelzellen exprimiert einzelnen Atemwegs / Longe AQPs und perfundierten Mauslunge sterben. Wir fanden hohe transepithelialen Wasserdurchlässigkeit (Pf . 54 ± 5 mgr; m / s) in Epithelzellen der Atemwege sterben schwach temperaturabhängig und Wurde gehemmt Durch gt; 90% Durch Reduzierte pH-Wert in der Basalmembran Gerichtete Lösung. Reverse-Transkription-PCR und Immunofluoreszenz vorgeschlagen, um sterben Beteiligung von AQPs 3, 4 und 5 in Hohen Atemwegswasserdurchlässigkeit. Experimente Mehrere empfindliche Messmethoden used gerechnet wurden, zeigten, Dass Amilorid nicht Wasserdurchlässigkeit in nicht-zystischer Fibrose (non-CF) oder CF Atemwegsepithelien, AQP-transfizierten Fisher Ratte Schilddrüsenzellen oder intakte Lunge nicht hemmt. Unsere Daten liefern Beweise gegen den Mechanismus von Donaldson vorgeschlagen et al. um Effekte von Amilorid und hypertonen Kochsalzlösung in CF Lungenerkrankung zu berücksichtigen sterben, war sterben notwendigkeit anzeigt, alternative Mechanismen zu identifizieren.

Cystische Fibrose (CF) 3 is a Relativ- Häufige Erbkrankheit bei Kaukasiern, verursacht Durch Mutationen im CF-Transmembran Regulator (CFTR) Chlorid-Kanal. Morbidität und Mortalität bei CF resultieren im Wesentlichen aus chronischen Atemwegsinfektion, sterben in der Fortschreit Verschlechterung Lungenfunktion Führt.

Zwei recently durchgeführte klinische Studien Haben Kurz- und langfristigen Nutzen von zerstäubten hypertonen Kochsalzlösung demonstriert bei der Aufgabe Verbesserung der Lungenfunktion bei CF (1. 2). Vor der Klinischen Studien Wirksamkeit verschiedener inhalierten hyperosmolar Mittel in CF (3 -6) unterstützen sterben. Die aktuelle Studie von Donaldson et al. (1) kommt zu DM Schluss that Hypertonus Saline anhaltende erhöhung der Atemwegsoberflächenflüssigkeit (ASL) Volumen Erzeugt, mukoziliäre verbessert Räumungs in sterben Atemwege sterben. Allerdings Wurde Eine paradoxe WIRKUNG gefunden, als Amilorid verabreicht Wurde, zusammen mit hypertonischer Kochsalzlösung. Anstätt sterben Lungenfunktion verbessert aufgrund ihrer Hemmwirkung auf ENaC und DAMIT Verhinderung von ASL Absorption, negiert Amilorid vorteilhafte WIRKUNG von hypertonischer Salzlösung sterben. Zur Berücksichtigung of this Erkenntnisse Donaldson et al. (1) postuliert, sterben Beteiligung von Atemwegs AQPs bei der Festlegung ASL Volumen (Abb. 1) und berichtet Amilorid Hemmung der osmotischen Wasserdurchlässigkeit in Epithelzellen der Atemwege STARKE. In IHREM Modell dehydriert ENaC Hyperaktivität der ASL in der CF-Atemwege (Abb. 1. Linkens Bedienfeld ) Und hypertonischen wieder ASL Kochsalzlösung Volumen (Mitteltafel ). If Amilorid nur auf ENaC Wirkt, Dann Amilorid Wird prognostiziert ASL Lautstärke zu erhöhen (Abb. 1. rechts, oben-Panel ). Um sterben Klinischen Daten ausmachen, sie vermuten, that Amilorid Atemwegs AQPs hemmt, sterben verhindert that Wasser in sterben Atemwege eintritt (Abb. 1. rechts, Bodenplatte ).

Die vorgeschlagene Einbeziehung von AQPs in ASL Regelung ist raschend sterben da Hemmung der AQP Wasserdurchlässigkeit von Amilorid ist. Osmotisch induzierte Wassertransport über Atemwege Wurde von Atemwegsepithelzellen Zellmonolayern (9), sterben aus hoch und wahrscheinlich AQP abhängig in microperfused kleinen Atemwege (7) und später in kultivierten Menschlichen tracheale Epithelzellen (8) und in Sphäroiden gezeigt Werden. Trotz of this, Reduktion von Atemwegsepithelzellen Wasserpermeabilität Durch Streichung der Verschiedenen Lungen / Atemwegs Aquaporine (AQPs 1, 3, 4 und 5) in transgenen Mausen Keinen einfluss ASL Volumen oder Ionenzusammensetzung (10) sterben. Die Hemmung der AQP Wasserdurchlässigkeit von Amilorid ist raschend, Weil Amilorid keine Aquaretikum WIRKUNG bei Konzentrationen Hut sterben ENaC in der renalen distalen Tubulus Hemmen.

Hier testeten wir Hypothese Donaldson sterben et al. (1) Durch Wasserdurchlässigkeit und Amilorid Effekte in Menschlichen bronchialen Epithelzellen Zellkulturen Charakterisierung stabil transfizierten Epithelzellen exprimiert Atemwegs / Longe AQPs und intakte Lunge Eine vielzahl von biophysikalischen Methoden unter verwendung von Wassertransport zu quantifizieren. Wasser Permeabilitäten von Atemwegszellen und intakten Lungenoberfläche gefunden gerechnet wurden hoch und AQP abhängig zu sein, obwohl Amilorid nicht Wasserpermeabilität Hemmen noch hat sie sterben Wasserdurchlässigkeit Status der einzelnen AQPs Hemmen. This ergebnisse Haben Wichtige Implikationen für das Deschamps nun der Nutzen der hypertonen Kochsalzlösung in CF und für sterben Zukünftige Entwicklung von verwandten Strategien zur Therapie von CF Lungenerkrankung.

Vorgeschlagener Mechanismus der hypertonischen und Kochsalzlösung Amilorid Auswirkungen auf Atemwegsflüssigkeit (ASL) bei zystischer Fibrose. In CF Wird periciliary ende Flüssigkeit wegen beeinträchtigter Cl verarmt — Sekretion Durch CFTR und erhöhte Na + Absorption Durch ENaC (Linkens Bedienfeld ). Hypertonus Kochsalzlösung Wird vorgeschlagen ASL Lautstärke zu erhöhen (Mitteltafel ) Über AQP-vermittelte und / oder Transwasserbewegung (blaue Pfeile ). Durch Die Hemmung von ENaC Wird Amilorid postuliert ASL Volumen zu erhöhen, INDEM Na + Blockierung und Flüssigkeitsaufnahme (rechts, oben-Panel ). Amilorid Hemmung der AQP Wasserkanäle Wurde als ein Mechanismus vorgeschlagen, tragen für den Amilorid Effekt Rechnung zu positiven Klinischen Effekte von hypertonischen negieren sterben Kochsalzlösung (rechts, Bodenplatte ).

Experimentellen VERFAHREN

Zellkultur -Oberflächen Bronchialen Epithelzellen gerechnet wurden von nicht-CF Menschlichen Lungenproben erhalten, sterben nicht geeignet für Eine Lungentransplantation Waren. CF bronchialen Epithelzellen gerechnet wurden von Patienten zum zeitpunkt der Transplantation erhalten. Die Zellen gerechnet wurden Durch Enzymatische Verdauung dissoziiert, Wie zuvor (11) beschrieben. 1-gemisch von Dulbecco modifiziertem Adler Medium und Ham-F-12-Medium, das 5% fötales Kälberserum (Hyclone, Logan, UT), Gentamicin (50 ug / ml), Penicillin (100 Einheiten / ml): Isolierte Zellen gerechnet wurden in Einem 1 suspendiert, Streptomycin (1 mg / ml) und Fungizon (2,5 mgr; g / ml) und als Passage 0 (P0) Kulturen bei Einer Dichte von 10 6 Zellen / cm 2 auf 12-mm-Transwell Polycarbonat Einsätze (0,4 um Porengrße ausgesät; Costar, Corning, NY) überlagert Dunnen SCHICHT mit Einer ( 15 mgr; g / cm 2) der Menschlichen Plazenta-Kollagen (Sigma-Aldrich). Am Nächsten Tag gerechnet wurden sterben Zellen Mit PBS gespült, und das Medium Wurde Mit Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche Medium (12) Enthält, Gentamicin, Penicillin und Streptomycin bei oben angegebenen Konzentrationen Ersetzt den. Das Medium Würde Täglich gewechselt. Wenn Die Zellschichten konfluent gerechnet wurden und aktiv absorbierten mukosalen ende Flüssigkeit, den Wie Durch VERLUST von apikalen ende Flüssigkeit in DM Zentralen Abschnitt des Einsatzes (in der Regel 3-5 Tage) Informationen angegeben ist, Wurde sterben Schleimhaut-OBERFLÄCHE MIT PBS gespült und Medium Wurde nur auf Form hinzugefügte basalen Seite des Einsatzes.

Bei Einigen Experimenten bronchialen Epithelzellen (non-CF und CF) gerechnet wurden in Menschlichen plazentalen kollagenbeschichteten Gewebekulturflaschen nach der Expansion erhalten Wird. Nach 80-90% Konfluenz unter verwendung von 0,05% Trypsin und 0,2% EDTA-Zellen gerechnet wurden bei 37 ° C in 0,9% NaCl gelöst. Das Trypsin mit Dulbeccos modifiziertem Adler Medium / Ham-F-12-Medium, enthaltend 20% fötales Kälberserum neutralisiert Wurde, und vermehrt Zellen gerechnet wurden in Plattierungsmedium resuspendiert und ausgesät auf Zellkultur-Einsätzen, Wie oben, Sondern als Passage 1 (P1) Kulturen bezeichnet beschrieben. Am Tag 15 nach DEM Aussäen Gebildet Torerfolg P0 und P1 Kulturen eng SCHICHTEN MIT transepithelialen Widerstand von 1-2 k Ω · cm 2, zu welchem ​​zeitpunkt gerechnet wurden sie für Experimente used. Die Kulturen gerechnet wurden wettet cAMP-aktivierte CFTR Durch messung des Kurzschlussstroms zum Ausdruck bringen, Wie zuvor (13) berichtet. Protokolle gerechnet wurden von der University of California, San Francisco Ausschuss für Humanforschung Genehmigt.

Fisher Ratten Schilddrüse (FRT) Epithelzellen stabil transfiziert mit Entweder Kontrollplasmid (kodierend gelb fluoreszierendes Protein) oder mit Plasmiden, kodierend AQP1, AQP3 oder AQP4 (14) gerechnet wurden mit 10 in F-12 / Coombs-Medium (Sigma-Aldrich) supplementiert gezüchtet fetale % Rinderserum (Hyclone), Penicillin G (100 Einheiten / ml), Streptomycin (100 ug / ml), und sterben Antibiotika-Selektionsmarker entsprechenden. Für Farbstoffdilution Experimenten gerechnet wurden FRT Zellen auf unbeschichtete Transwell-Einsätze plattiert und Flussmessungen ein Widerständen von 2-5 used k Ω · cm 2.

Transepithelialen Wasserdurchlässigkeit -Die osmotische Wasserpermeabilitäten über menschliche Bronchialepithelzellen (HBE) und FRT Zellschichten gerechnet wurden unter verwendung Eines Farbstoffverdünnungsmethode Bestimmt, Wie in Abb. 2EIN . Die Verdünnung Eines zell impermeant, photostabile, inerten Farbstoff (Texas Red ™ -Dextran, 10 kDa, Molecular Probes, Eugene, OR) Wurde als Maß für transzellularen osmotische Wasserfluss eingesetzt. Die basale OBERFLÄCHE von Zellen Auf dem porösen Filter Wurde in 1 ml isosmolar PBS getaucht. Der apikalen OBERFLÄCHE Wurde in 200 ul hyperosmolar PBS (PBS + 300 m m d -Mannit), enthaltend 0,25 mg / ml Texas Red-Dextran gebadet. In Einigen Experimenten, mgr; 100-500 m Amilorid (Sigma-Aldrich), gelöst frisch aus Pulver, zum apikalen Puffer zugegeben Wurde, Wie von Donaldson Getan et al. (1) oder Sowohl Auf die apikale und basale Badepuffer. Die Kulturen gerechnet wurden in Einer 5% CO platziert2 Gewebekultur-Inkubator (bei 27 oder 37 ° C), und 5 ul-Proben von farbstoffhaltigen apikalen ende Flüssigkeit gerechnet wurden zu bestimmten Zeitpunkten gesammelt. Die Proben gerechnet wurden in 2 ml PBS verdünnt, und Fluoreszenz, sterben Durch Fluorimetrie Küvette (Fluoro Max-3; Horiba, Tokyo, Japan) gemessen. In Einigen Experimenten Würde der osmotische Gradient Durch Die ZUGABE von Mannit zu DEM basalen umgekehrt statt der farbstoffhaltigen apikalen Lösung. In anderen Experimenten Würde pH der der Entweder sterben basale oder apikalen Lösungen auf 5,0 eingestellt OP unter verwendung von Puffern, enthaltend 137,6 m m NaCl, 5 m m KCl, 2 m m CaCl2. 1 m m MgCl2. 6 m m d -Glucose und 10 m m HEPES (bei pH 7,4) oder MES (bei pH 5,0). In Einigen Experimenten HgCl2 (0,2 oder 1 m m) Wurde zu DEM apikalen und basolateralen Lösungen 5 min Vor dem osmotischen Gradienten.

Zur Berechnung von transepithelial osmotischen Wasser Permeabilitätskoeffizienten (Pf . in cm / s), der Zeitverlauf der Fluoreszenz in Reaktion auf Änderungen Lösung Osmolarität F (t ) Wurde zu Einer einzigen exponentiellen Zeitkonstante Versehen, F (t ) /FO = B + EIN ·et / Τ. woher FO anfängliche Fluoreszenz, EIN Amplitude ist, und τ ist sterben exponentielle Zeitkonstante. Aufgrund der Farbstoffbindung ein Zellen und / oder DM Träger, Daten für sterben exponentielle Regression Wurde used, um 5 min gesammelt und später nach den osmotischen Gradienten schaffen. Wasserdurchfluss Würde als geschwindigkeit der Farbstoffverdünnungs von d berechnet sterbenV (0) / dt = VO ·EIN / Τ, aus der Beziehung folgt sterben: F (t ) /FO = VO / (VO + V (t )). VO ist das Anfangsvolumen des farbstoffhaltigen apikale Puffer (0,2 cm 3) und V (t ) Ist der apikale Lösungsvolumen zum zeitpunkt t. Aus Diesen Gleichungen Pf Wurde als d berechnetV (0) / dt = Pf ·S ·vw · (Φ1 — Φ2 ), Woher S ist Die Eine glatte Öberfläche (1,13 cm 2) unter der annahme, OBERFLÄCHE Gewebe, vw ist sterben partielle Molvolumen von Wasser (18 cm 3 / mol) und (Φ1 — Φ2 ) Ist der transepithelialen osmotischen Gradienten (3 × 10 -4 mol / cm 3).

Plasmamembran Wasserdurchlässigkeit -Plasma Membranpermeabilität Osmosewasser Wurde mit Einems calceinquenching Elle Verfahren (in Abb. 3 gezeigtEIN ), Die zuvor aufgetragen Wurde, um in vitro und in vivo Zellsysteme (15 16). Zellen gerechnet wurden mit Calcein beladen Durch Inkubation mit PBS 10 μ m Calcein-AM (Molecular Probes) für 30 min bei 37 ° C Enthält. HBE Kulturen auf Träger gezüchtet gerechnet wurden untersucht, INDEM sterben flache Träger aus den Kunststoff-Schneideinsätzen und sie in Einems speziell® angefertigten Perfusionskammer mit Unterstützung Böden Gedruckt gegen Eine Deck und apikalen Zelloberflächen zum Perfusat Ausgesetzt Montage Kollagen-beschichteten. FRT-Zellen auf Glasdeckgläschen gezüchtet gerechnet wurden in ähnlicher Perfusionskammer eingesetzt, Aber Mit Zellen nach oben zeigt. Die Lösungen gerechnet wurden between PBS (290 mOsm) und hyperosmolare PBS (590 mOsm, PBS mit Zusatz d -Mannit) mit Einems Schwerkraft Quetschventil (ALA Scientific Instruments, Westbury, NY) ausgetauscht. Perfusaten enthielten Entweder Me2 SO Fahrzeug (0,1%) oder Amilorid (500 μ m) hinzugefügt von 1000 × Me2 SO-Stammlösung. Die Fluoreszenz Wurde unter verwendung Eines X-Cite 120 Quecksilberlampe (EXFO Life Sciences, Ontario, Kanada) angeregt und fokussiert Durch Eine umgekehrte Epifluoreszenzmikroskope Durch EINEN Langen Arbeitsabstand 25 x Luftziel (numerische Apertur 0,35, Leitz). Anregungs- und Emissionslicht Wurde mit Einems benutzerdefinierten Würfel (Chroma, Rockingham, VT) gefiltert, und sterben Fluoreszenz Würde ein 14-Dynode Photomultiplier gesammelt und anschließend VERSTÄRKT, digitalisiert und in LabView, National Instruments, Austin, TX mit kundenspezifischer Software (geschrieben aufgezeichnet) .

Zur Berechnung der Plasmamembran Pf . relativen Fluoreszenz (F (t ) /FO ) Wurde zu Einer einzigen Exponentialfunktion (wie oben) für FRT Zellstudien oder biexponentiellen Funktion equipped (F (t ) /FO = EIN ·et / Τ1 + B ·et / Τ2 + C ) Für HBE-Studien. Plasma-Membran Pf oben Wurde wie beschrieben berechnet, Wobei Oberflächenbereich S Wurde als sterben apikale OBERFLÄCHE der Zellschicht aufgenommen, Eine flache, glatte Öberfläche annehmen. Die zeitveränderliche Zellschichthöhe, h (t ) Anfänglichen Höhe Wurde von der entsprechend der vorhergesagten 50% Endgültige Abnahme zu normalisierten Amplituden im zusammenhang mit (hO ) Unter hypertonischen bedingungen. Für FRT und HBE-Zellen, hO Wurde als 5 und 20 mgr; m BZW. entnommen. Pf Wurde Dann von d berechneth (0) / dt = Pf · vw · (Φ1 — Φ2 ).

Airspace-Kapillar-Wasserdurchlässigkeit in Intact Lung — Wild typ- und AQP5-defiziente Mäuse in Einems CD1 genetischen Hintergrund (im Alter von 8-14 Wochen) (17) gerechnet wurden unter verwendung Einer Überdosis von 2,2,2-Tribromethanol (Avertin, Sigma-Aldrich) intraperitoneale geopfert. Protokolle gerechnet wurden von der University of California, San Francisco Ausschuss für Tierforschung Genehmigt. Die Luftröhre durchtrennt Wurde and a Kanüle in Hollywood sterben Wurde Lungenarterie kanüliert, und das Herz und sterben Lungen gerechnet wurden verschoben Am Stück zu Einer Kammer Perfusions, Wie zuvor (18) beschrieben. Once sichergestellt ist, Dass keine Luftleckstellen vorhanden Waren, gerechnet wurden 0,5 ml Fluorescein-Isothiocyanat-Dextran-Lösung (10 kDa, 0,5 mg / ml in PBS, Sigma-Aldrich), mit oder ohne frisch gelöstes Amilorid (500 μ m ), Wurde in sterben Trachea instilliert Katheter. Sterben Lungenarterie Würde bei konstantem Druck (~ 60 cm H perfundiert2 O) Mit PBS mit oder ohne 500 mgr; m Amilorid, für mindestens 5 min vor der MESSUNG. Die Pleuraoberfläche Wurde kontinuierlich Mit PBS gewaschen und Perfusat und wasche Abstrom gerechnet wurden aus der Kammer Durch Saugwirkung (Perfusat Strom 5 ml / min) kontinuierlich abgezogen. Der zeitliche Verlauf der Fluoreszenzintensität von Einems 3-5 mm Fleck auf der Lunge Pleuraoberfläche, in Einer ähnlichen Lage für alle Proben Wurde kontinuierlich Überwacht, während Perfusionsflüssigkeit between isosmolar und hyperosmolare PBS (PBS + 300 MMD -Mannit) ausgetauscht Wurde mit das Mikroskopaufbau, Detektionssystem, sterben und Schwerkraft Quetschventil oben beschrieben.

Histologie und Immunzytochemie Paraffinschnitte von P0 HBE Zellkultureinsätze und feste menschliche Luftröhre Hergestellt. Für Paraffinschnitte gerechnet wurden Einsätze für mindestens 30 Minuten in gepuffertem Formalin (10%) und gelagert in 0,1 m Phosphatpuffer (pH 7,4) Fixiert. Standardgewebe Dehydratisierung und Paraffin Infiltrations Würde in Einems Tissue-Tek VIP-Prozessor (Sakura Finetek, Torrance, CA) durchgeführt. Die Schnitte gerechnet wurden bei 4 mgr; m Auf einem Rotationsmikrotom und gefärbt mit Hämatoxylin und Eosin schneiden. Die Proben gerechnet wurden Auf einem Olympus Lichtmikroskop (Olympus America, Inc. Melville, NY) betrachtet und fotografiert mit Einems Digitalen Bildsystem equipped (QImaging, Burnaby, Kanada). Immunfärbung Wurde Durch Standardverfahren durchgeführt unter verwendung von polyklonalen Antikörpern für AQP3, AQP4 und AQP5 (Chemicon, Temecula, CA) inkubiert für 2 h und Cy3-konjugiertem Ziege-anti-Maus-IgG (1: 200, Sigma-Aldrich) für 30 min inkubiert.

Reverse-Transkription (RT) -PCR -Die Gesamt-RNA aus HBE-Zellen frisch aus P0 Kultureinsätze abgeschabt Wurde Durch Homogenisieren in TRIzol-Reagens (Invitrogen) isoliert, und mRNA Würde unter verwendung des Oligotex mRNA Midi Kit extrahiert (Qiagen, Valencia, CA). cDNA Würde aus mRNA mit Oligo (dT) (Superscript II Vorverstärkung Kit, Invitrogen) revers transkribiert. Primer gerechnet wurden Entworfen, 300-350 Basenpaar-Fragmente der cDNAs, sterben menschliches β-Actin zu amplifizieren (Sense, 5′-GCATGGAGTCCTGTGGCATCC-3 ‘; Antisense-, 5′-CATTTGCGGTGGACGATGGAC-3′), AQP1 (Sense, 5’-GCCATCG GCCTCTCTGTAGCC- 3 ‘; Antisense-5′-CTATTTGGGCTTCATCTGCAC-3′), AQP2 (Sense, 5’-ACCTCCTTGGGATCCATTACA-3 ‘; Antisense, 5′-TCAGGCCTTGGTACCCCGTGG-3′), AQP3 (Sense, 5’-CTGGTGGTCCTGGTCATTGGC-3 ‘ Antisense, 5’-CTGCTCCTTGTGCTTCACATG-3 ‘), AQP4 (Sense, 5′-GGACCTGCAGTTATCATGGGA-3′; Antisense, 5’-CAATACCTCTCCAGATTGTGC-3 ‘), AQP5 (Sense, 5′-CTGTCCATTGGCCTGTCTGTC-3’, Antisense, 5 ‘-GCGGGTGGTCAGCTCCATGGT -3′), AQP6 (Sense, 5’-CTGGGCCACCTCATTGGGATC-3 ‘; Antisense, 5′-TCACACACTCTCCATCTCCAC-3), AQP7 (Sense, 5′-CAGGTCTTCAGCAATGGGGAG-3′; Antisense, 5’-CTCTAGGGCCATGGATTCATG-3 ‘), AQP8 (Sense, 5′-GTGGCAGAGATCATCCTGACG-3′; Antisense, 5’-TTCAGGATGAGGCGGGTCTTC-3 ‘) und AQP9 (Sense, 5′-GACTCCAGAAACTTGGGAGCC-3′; Antisense, 5’-TTGTCCTCAGATTGTTCTGCC-3 ‘). RT-PCR (zum gefärbten Agarosegele) Wurde mit der durchgeführt Taq DNA-Polymerase-Kits (Invitrogen), und PCR-Produkte gerechnet wurden Auf einem 1,2% Agarosegel elektrophoretisiert.

Fluoreszenz-basierte Echtzeit-RT-PCR erfolgte Relativ- AQP3 zu Vergleichen, AQP4 und AQP5-mRNA-Expression in nicht-CF gegen CF Zellen das LightCycler ™ used und with the LightCycler Faststart DNA Master Plus SYBR Green I Kit (Roche Diagnostics) Gemss den Anweisungen des Herstellers. Oberflächen aus Epithelzellen gerechnet wurden Menschlichen Bronchien distanzierte, tiefgefroren und bei -80 ° C gelagert, bis sie für RNA-Isolierung aufgetaut sterben. PCR-Primer gerechnet wurden Wie oben beschrieben. Die ergebnisse gerechnet wurden Informationen angegeben als ein normierter, kalibrierten Verhaltnis bei allen Proben zu Beta; Actin-normalisiert. Konzentrationsverhältnisse für JEDE CF und nicht-CF Probe gerechnet wurden auf Kalibratorproben kalibriert (gepoolte cDNA, aus nicht-CF Patienten sterben), Wobei ergebnisse sterben als ein normalisiertes Verhaltnis with the Kalibrator Probe als Nenner berichtet Wie folgt: relative mRNA-Ebene = Verhaltnis der Probe (Soll / Referenz) / Verhaltnis von Kalibrator (Soll / Referenz).

ergebnisse

Wassertransport in Epithel Atemwegsoberfläche Würde gut Mit differenzierten HBE Zellkulturen untersucht. Transepithelial osmotische Wasserdurchlässigkeit Wurde unter verwendung Eines Farbstoffverdünnungsmethode gemessen, der Wasserfluss über dicht Epithelien Assays kultiviert auf porösen Filter (Abb. 2EIN ). Die Fluoreszenz Eines apikal Lösungsvolumen Marker zur verfügung Gestellt, Eine quantitative Auslesen von osmotisch angetriebene Wassertransport Gesetz über die Zellschicht. Eine induzierte Osmosegradienten verursacht transepithelialen Wasserbewegung, aus der osmotischen Wasserdurchlässigkeit (Pf ) Wurde abgeleitet. Die P0 Non-CF-Kulturen gerechnet wurden zunächst aus. Feige. 2B (oben ) Zeigt Fluoreszenz Verdünnung bei 37 ° C, in DM ein 300 m m-Gradienten von d -Mannit osmotische Wasserfluss in sterben apikale, farbstoffhaltigen Lösung induziert. Daten bei fehlen gegen sterben anwesenheit von Amilorid (500 mgr; m) gerechnet wurden verglichen. Feige. 2C FASST transepithelial Pf Werte. Es gab Keinen signifikanten Unterschied in der Pf bei Einwirkung von P0 HBE Kulturen zu hohe Dosis Amilorid (Kontrolle gegen Amilorid, 54 ± 5 gegen 52 ± 7 um / s). Niedrigere Konzentrationen von Amilorid (100 und 250 μ m) änderte Sich auch nicht Pf (Nicht gezeigt).

Wenn Die RICHTUNG des osmotischen Gradienten Durch Die ZUGABE von Mannit zum basalen Badlösung umgekehrt Wurde, Wurde sterben Fluoreszenzmarkierungsvolumen über Zeit (Abb Konzentriert sterben. 2B . Mitte ). Die abgeleitete transepithelialen Pf (46 ± 15 mgr; m / s) unterscheiden Sich nicht merkbar von der in Kontrollstudien (Mannit in apikal-Lösung), war darauf hinweist symmetrischen Wassertransport. Um sterben Beteiligung von AQPs in HBE Wasserdurchlässigkeit zu untersuchen, gerechnet wurden Experimente bei erniedrigter Temperatur (27 ° C) und mit reduzierter pH-Wert in den apikalen oder basalen Badelösungen (Abb Getan. 2C . Boden ). Pf bei 27 ° C (47 ± 9 mgr; m / s) bei 37 ° C, sterben ähnlich, mit Einem niedrigen Arrhenius-Aktivierungsenergie angibt, Wie für AQP-erleichterte Wassertransport Erwartet. Reduzierung der apikal Lösung pH-Wert auf 5 nicht ÄNDERN Pf merkbar, während Eine basolaterale Lösung pH-Wert von 5 verringert Pf Durch gt; 90%, Funktionelle Beweise für sterben Beteiligung der basolateralen Membran AQP3 in Wasserdurchlässigkeit bereitstellt; Wasserdurchlässigkeit von AQP3 bei niedrigen pH inhibiert sterben, wohingegen der Anderer AQPs nicht (19).

Transepithelialen Wasserdurchlässigkeit der Menschlichen Bronchial-Zellkulturen. Wasserdurchlässigkeit in SCHICHTEN HBE Zelle Durch Eine Farbstoffverdünnungsfluoreszenzverfahren gemessen. EIN. Schema osmotisch transzellularen Wasserfluss über poröse Membranen Transwell induziert. Wasserbewegung von basal nach apikal Lösungen verringert sterben KONZENTRATION Eines inerten Markierungsvolumen in der apikalen Lösung. B. Zeitverlauf der osmotischen Wasserbewegung über P0 HBE Zellkulturen, mit Fluoreszenz apikal Lösung normalisiert als F /FO . und einzelne exponentielle Anpassungen gezeigt als gezogenen Linien (Siehe «Versuchsverfahren»). oben. Vergleich von Kontrollkulturen (offene Kreise ) Mit 500 exponierten Kulturen mgr; m Amilorid eine ihrer apikalen OBERFLÄCHE (geschlossene Kreise ). Messungen bei 37 ° C (7 Kulturen / Gruppe ± S. E.) durchgeführt. Mitte. Zeitverlauf der apikalen Lösung Fluoreszenz bei Aufnahme von 300 m m d -Mannit in basalen (statt apikal) OBERFLÄCHE gerichteten Puffer (37 ° C, ± vier Kulturen S. E.). Boden. Vergleich von Kontrollkulturen (offene Kreise mit Kulturen) eine Empfehlung: Ihren apikal niedrigen pH-Wert Ausgesetzt (offene Dreiecke ) Oder basolateralen (offene Quadrate ) Oberflächen (27 ° C, vier Kulturen ± S. E.). C. Zusammenfassung von Pf für Experimente, in B. *. p lt; 0,05. D. Zusammenfassung von Pf für auf P1 nicht-CF und CF HBE-Zellen durchgeführt Experimente in Abwesenheit und anwesenheit von 500 μ m apikalen Amilorid (37 deg; C, 4 Kulturen Amt für JEDE nicht-CF-Gruppe und Fünf Kulturen für JEDE Gruppe CF ± S. E.). E. Zeitverlauf der osmotischen Wasserbewegung über HBE-Zellen P0, verglichen Kontrollkulturen (offene Kreise ) Mit 500 exponierten Kulturen mgr; m Amilorid eine apikalen und basolateralen Beiden Oberflächen (geschlossene Kreise ). Daten, ausgedrückt als absolute Fluoreszenz in willkürlichen Einheiten (vier Kulturen / Gruppe ± S. E.).

Nicht-CF und CF P1 Zellkulturen untersucht auch von Donaldson eingesetzt, um Kulturbedingungen zu imitieren sterben et al. (1). Wie in Abb zusammengefasst. 2D . P1 Kulturen Hatten ~ 50% Niedriger Wasserdurchlässigkeit als P0 Kulturen, aber ohne signifikante unterschiede nicht-CF Vergleich gegen CF Kulturen oder Kontrollkulturen gegen apikal bis 500 μ m Amilorid exponierten Kulturen (oder BIS 100 μ m Amilorid, nicht gezeigt). Schließlich als Zusätzlicher Versuch für Amilorid-sensitiven Wassertransport zu suchen, Wurde sterben Wasserdurchlässigkeit gemessen in P0 Non-CF-Kulturen in Gegenwart von apikal Sowohl und basolaterally hinzugefügt Amilorid (500 μ m). Wie aus den Rohen Fluoreszenzdaten Sind in Abb. 2E . osmotische Wasserfluss nicht Durch hochdosierte Amilorid gehemmt, das fehlen von Amilorid Hemmung der apikalen oder basolateralen AQPs angibt.

Plasma-Membran Wasserdurchlässigkeit der Menschlichen Bronchial-Zellkulturen. Wasserdurchlässigkeit Durch Eine Calceinfluoreszenz-Abschreckungsverfahren gemessen. EIN. Schema zellvolumenabhängigen Calcein abschrecken, wo apikalen Plasmamembran der Exposition Gegenüber hypertonischer Pufferzelle Schrumpfung induziert aufgrund des Abschreckens zytoplasmatischen Calcein-Fluoreszenz Reduktions Durch anionische cytoplasmatischen Proteinen. B. Vertreter Zeitverläufe der Calceinfluoreszenz in HBE-Zellen als Reaktion Herausforderung Durch Rückkehr zu isosmolar Lösung gefolgt hyperosmolare, in Abwesenheit (oben ) Oder anwesenheit (Boden ) Von 500 mgr; m Amilorid. Doppel exponentielle Anpassungen used für Pf Determination überlagert ( «Experimentelle Verfahren» zu Sehen). C. Zusammenfassung der berechneten Pf (3-6 Kurven gemittelt für einzelne Kulturen, drei Kulturen / Zustand ± S. E.). Unterschiede Waren nicht merkbar.

Plasmamembran Wasserpermeabilität in P0 HBE Kulturen Wurde unter verwendung Eines Calcein-Quenching-Verfahren Bestimmt, auf schnelle Änderungen in cytoplasmatischen Calcein-Fluoreszenz in Reaktion auf Änderungen in der KONZENTRATION von cytoplasmatischen anionischen Proteine ​​und DAMIT zu Veränderungen im Zellvolumen (Abb basiert sterben. 3EIN ) (15 ). Unterstützt mit Calcein belasteten HBE-Zellen zur kontinuierlichen messung der cytoplasmatischen Calceinfluoreszenz in Einer Perfusionskammer montiert gerechnet wurden. Das Umschalten between isosmolar und hyperosmolar perfusates reversible Veränderungen in der Fluoreszenz mit biexponentiellen Kinetik (Abb. 3B ), Wahrscheinlich heterogene verteilung der sterben AQPs und sterben Komplizierte Geometrie der bronchialen Epithels widerspiegelt. Pf Wie aus den Anfangs Kinetik der Fluoreszenzänderung in Reaktion auf den osmotischen Gradienten quantifiziert Wie unter «Experimentelle Verfahren». In Abb zusammengefasst. 3C, Die Plasmamembran Pf nicht wesentlich Durch Die Aufnahme von 500 mgr; m Amilorid in den perfusates betroffen Krieg.

AQP-Expression in Würde P0 HBE-Zellen charakterisiert. Hämatoxylin und Eosin-gefärbte Querparaffinschnitten wettet sterben Differenzierung von 2 Wochen alten Kulturen in Eine ~ 20 & mgr; m dicke mehrreihigen Epithel mit zahlreichen Zilien (Abb. 4EIN ). Die Kulturen gerechnet wurden for the RT-PCR-Analyse geschabt sterben mRNA für Mehrere AQPs Nachgewiesen (Abb. 4B ). Transkripte von AQP3, AQP4 und AQP5 gerechnet wurden in Höchster Fülle, im Einklang mit früheren Studien (siehe «Diskussion») gefunden. Lesser, Aber nicht Null Ausdruck von AQP1, AQP6 und AQP7 mRNA Nachgewiesen Wurde. Quantitative real-time RT-PCR Würde sterben Expression der Haupt AQPs in P0 HBE Kulturen aus Nicht-CF zu Vergleichen Getan gegen CF Atemwege. Wie in Abb zusammengefasst. 4C . Würden keine signifikanten unterschiede in AQP Transkriptexpression in nicht-CF gefunden gegen CF-Zellen. Immunofluoreszenz Getan auf Paraffinschnitten von HBE Kulturen und intakte menschliche Bronchus demonstriert AQP3 und AQP4-Protein-Expression auf Membranen, während AQP5 Proteinexpression nicht Erkannt Wurde basolateralen. Positive Kontrollfärbung von Nieren für AQP3 und AQP4 Wird gezeigt und der Speicheldrüse für AQP5.

Wir untersuchten als nächstes sterben möglichen Auswirkungen von Amilorid auf Die großen Lungen AQPs einschließlich AQP1 (in mikrovaskulären Endothel ausgedrückt Wird), unter verwendung AQP transfizierten Epithelzellen und intakten Maus-Lunge. Transepithelial und Plasmamembran Wasserpermeabilitäten gerechnet wurden in FRT-Zellen, sterben Entweder gelb fluoreszierendes Protein (Kontrolle), AQP1, AQP3 oder AQP4 gemessen. Transepithelialen Wasserdurchlässigkeit von FRT-Zelllinien auf Transwell-Trägern gezüchtet Wurde gemessen, Once Kulturen sterben elektrisch dichte Monoschichten Gebildet. Wasser Permeabilitäten von AQP FRT-exprimierenden Zellen Waren Grösser als in Kontrollzellen und nicht empfindlich auf sterben Amilorid (Abb. 5EIN, oben ). Feige. 5EIN (Boden ) Fasst transepithelial Pf Werte. Plasma-Membran Wasserdurchlässigkeit Wurde auf den FRT-Zellen gemessen, mit Kurven Calceinfluoreszenz auf einzelne exponentielle Funktionen equipped (repräsentative Spuren für FRT-AQP3 und FRT-AQP4 in Abb Zellen. 5B, oben ). In Übereinstimmung mit den Messungen von transepithelialen Wasserdurchlässigkeit, Plasmamembran Pf Wurde mit AQP Expression erhöht und nicht empfindlich auf Amilorid (Abb. 5B, Boden ).

Schließlich Wurde sterben WIRKUNG von Amilorid in intakten, perfundierten Mauslunge sucht Eine Pleuraoberfläche Methode Luftraum-Kapillar osmotischen Wasserdurchlässigkeit (18) zu messen. Der Luftraum Raum Wurde mit isotonischer ende Flüssigkeit Enthält Fluoresceinisothiocyanat-Dextran als Volumen Marker gefüllt. Die Kinetik der pleuralen OBERFLÄCHE Fluoresceinisothiocyanat-Dextran-Fluoreszenz in Reaktion auf Änderungen in der Osmolalität der Pulmonalarterie Perfusat gemessen. Es war Eine schnelle osmotisches Gleichgewicht über den Luftraum-Kapillare Barriere, sterben sterben nicht Durch Einbeziehung von 500 mgr; m Amilorid in den AtemWeg instillate und Pulmonalarterie Perfusat (Abb betroffen Krieg. 6EIN, oben ). In Übereinstimmung mit früheren Ergebnissen Sie (20), ein osmotisches Gleichgewicht Krieg ~ 10-fache verlangsamt in den Lungen von AQP5-defizienten Mausen (Abb. 6EIN, Boden Die), Beteiligung von AQP5 in Luftraum-Kapillare osmotischen Wassertransport anzeigt. Die Raten der osmotischen Wasserausgleich in den Lungen von Wildtyp-Mausen (mit und ohne Amilorid) Sind in Abb zusammengefasst. 6B .

Aquaporin Expression in Epithelzellen der Menschlichen Atemwege.EIN. Histologie von gut HBE Zellen differenziert. Hämatoxylin und Eosin-gefärbte Abschnitt Schnitt von Non-CF-Kultur in Paraffin Eingebettet. Maßstabsbalken. 20 mgr; Meter B. AQP Transkriptexpression in HBE Kulturen. oben. RT-PCR-Analyse von HBE Kulturen. Boden. positive Kontrolle aus cDNA Genommen gepoolt aus menschlichem Gehirn, Niere und Lunge. C. Quantifizierung der relativen AQP3, AQP4 und AQP5 mRNA-Expression in P0 CF gegen Nicht-CF HBE-Zellen Durch Fluoreszenz-basierten RT-PCR (siehe «Experimentelle Verfahren», zwei CF und drei nicht-CF Thema Isolat ± S. E. Analysiert). D. AQP3, AQP4 und AQP5 Immunfärbung von Paraffinschnitten von humanen Bronchus Gewebe (Toppanels ), HBE Kultur (Mittelplatten ) Und positive kontrollen (Maus Nierenrinde, unten links ; Nierenmark, unten in der Mitte ; Speicheldrüse, rechts unten ). Pfeile bezeichnen apikalen Seite und Pfeilspitzen bezeichnen basalen Seite. Maßstabsbalken. 50 & mgr; m. Fortsetzung. steuern.

DISKUSSION

Das primare Ziel of this Studie war es, Eine vorgeschlagene AQP-abhängigen Mechanismus zu untersuchen, für Klinischen wirkungen von zerstäubten hypertonen Kochsalzlösung (HS) und Amilorid auf sterben Lungenfunktion in CF. sterben zu berücksichtigen Die Gültigkeit des vorgeschlagenen Mechanismus des Klinischen Nutzens Amilorid-sensitiven Atemwegs AQPs beteiligt Hut Wichtige Auswirkungen in BEZUG auf sterben verwendung von HS gegen Nicht-Salz hyperosmolare Mittel in CF-Therapie, Eulen in der vorgeschlagenen verwendung von Amilorid-Typ ENaC-Inhibitoren in ASL zu verhindern Austrocknung.

HS Wird zunehmend als Eine chronische Therapie bei Mukoviszidose, insbesondere nach der Jüngsten VERÖFFENTLICHUNG von Zwei Klinischen Studien im New England Journal of Medicine zeigt Klinischen Nutzen (1. 2) used Wird. Die Größere der Beiden Studien berichteten that 4 ml 7% HS Zweimal Täglich vernebelt 48 Wochen lang Exazerbationsrate bei CF Probanden um 56% verringert (2). Exazerbationen gerechnet wurden Durch Die notwendigkeit zur intravenösen Antibiotika oder mit Einems Symptom-Score mit erhöhtem Auswurf, Lethargie, Dyspnoe und Fieber Definiert. In früheren Studien von kleineren CF Probanden, Eine einzige vernebelten Dosis von 6-7% HS erhöht mukoziliäre Räumungs bei 60 und 90 Minuten, Wie Durch Radionuklid-Bildgebung gemessen (3, 5). Erhöhte mukoziliäre Räumungs Krieg dosisabhängig bis zu 12% HS in 10 Erwachsene mit Einer einzigen Dosis Behandelt und getestet bei 90 min (4). In Einem 2-Wochen-Studie in 52 CF Probanden gerechnet wurden 10 ml 6% HS verbessert sterben Lungenfunktion, Wie Durch Eine 12% ige erhöhung der forcierten exspiratorischen Volumen in 1 s (FEV1) (6) gemessen. HS würde auch mukoziliäre Räumungs bei Gesunden Probanden und bei Patienten mit Asthma oder chronisch-obstruktiver Lungenerkrankung (21, 22) zu erhöhen gezeigt.

Verschiedene Nicht-Salz hyperosmolar Mittel gerechnet wurden Gesetzt, um Schleim-Ausverkauf bei CF und Ande chronischen entzündlichen Lungenerkrankungen zu verbessern. Sterben Am Besten untersuchten Nicht-Salz hyperosmolare Mittel ist Mannit. In 12 CF Probanden gerechnet wurden Einzeldosis von 300 mg Mannit als ein trockenes Pulver Bronchialschleim Räumungs bei 60 min verbessert, Auch Wenn Es EINEN kleinen Rückgang der FEV1 sofort nach der Inhalation Krieg, sterben nicht mehr reagierte Prämedikation Bronchodilatator (5). Die same Dosis von Mannit verbessert Schleim-Räumungs 2-fach bei Gesunden, asthmatisch, und bronchiektatische Themen (21. 23). Ein 12-Tage-Testversion von 400 mg Mannit Täglich in neun nicht-CF bronchiektatische Probanden gab keine veränderung der FEV1, Sondern verschiedene Sputum verbesserte Eigenschaften, Wie Oberflächenspannung und spinnbarkeit (24). Ein further inhaliert hyperosmolar Mittel, Xylit, REDUZIERT ASL Salzkonzentration in CF und nicht-CF Atemwegsepithelien in vitro (25). Vorbehandlung der Menschlichen Atemwege Explantat für 1 h mit 60 bis 80 mg / ml Xylitol REDUZIERT Einer Bindung Burkholderia cepacia isolieren (26).

Transepithelial und Membran Wasserpermeabilitäten in AQP-transfizierten FRT Zellkulturen.EIN. transepithelial osmotische Wasserdurchlässigkeit von transfizierten FRT-Zellen Durch Farbstoff-Verdünnung gemessen. oben. gemittelte Zeitverläufe der osmotischen Wasserbewegung in FRT Zellkulturen mit gelb fluoreszierenden Protein transfiziert (YFP ) (Kreise ), AQP1 (Quadratisch ), AQP3 (Diamanten ) Und AQP4 (Dreiecke ) Mit apikal Lösung Fluoreszenz normalisiert als F /FO . Kontrollkulturen (offene Symbole ) Waren im Vergleich zu 500 exponierten Kulturen mgr; m Amilorid eine ihrer apikalen OBERFLÄCHE (geschlossene Symbole ). Messungen bei 37 ° C (drei Kulturen / Gruppe ± S. E.) durchgeführt. Einzelne exponentielle Anpassungen Werden gezeigt, Wie gezogenen Linien. Boden. Zusammenfassung von Pf Werte. Unterschiede Waren nicht merkbar. B. Plasmamembran osmotische Wasserpermeabilitäten Gelbfluoreszierende protein- und AQP-transfizierten FRT Zellen gemessen Durch abschrecken Calcein. oben. Vertreter Zeitverläufe der Calceinfluoreszenz in Kulturen von AQP3 (Obere Kurve ) — Und AQP4 (untere Kurve Als) reaction transfizierten Zellen Herausforderung und Rückkehr zu isosmolar Lösung, in Abwesenheit von Amilorid auf hyperosmolare. Boden. Zusammenfassung von Pf (4-8 Kurven gemittelt aus einzelnen Kulturen, drei Sätze von Kulturen / Zustand ± S. E.). Unterschiede Waren nicht merkbar.

Im Rahmen der vorliegenden Studie, sind wir für AQP Expression und Funktion in den Wassertransport Durch Die menschliche bronchialen Epithelzellen. Wie in der Einleitung Erwähnt, von Donaldson Eine zentrale Vorhersage des Mechanismus vorgeschlagen et al. (1) ist der Hemmung AQP Wasserpermeabilität Durch Amilorid sterben. Um Ihre Mechanismus unterstützen, die Autoren transepithelialen Fluß über HBE Kulturen in Reaktion Auf eine apikal Gerichtete Mannit Gradienten gemessen, Wie hier (Abb Getan. 2EIN ) Mit zwei Unterschieden. Erstens, in ihrer Studie sterben KONZENTRATION von Texas Red-Dextran Wurde in der basolateralen (statt der apikalen) Lösung gemessen. Zweitens, in ihrer Studie Würde Fluoreszenz Durch konfokale Mikroskopie ohne Puffer Probenahme gemessen. Sie Erfasst Membrantransportraten Wie Veränderungen in der Zellhöhe im laufe der Zeit, mit zytoplasmatischen Calceinfluoreszenz Abgebildet unter verwendung des rekonstruierten x-z konfokalen Stacks. Von Beiden Ansätze berichteten sie ein gt; 70% ige Reduktion der osmotischen Wassertransport von 100-400 mgr; m Amilorid in nicht-CF und CF HBE Kulturen. Amilorid verhindert Auch sterben vorübergehende erhöhung der ASL Volumen beim Akuten ZUGABE von Perfluorkohlenstoff-dispergierte NaCl ein Schleimhautoberfläche der epithelialen Kulturen, obwohl of this Ansatz nicht ein Direktes Maß für den osmotischen Wasserdurchlässigkeit bereitstellt und Wurde DAHER hier nicht Wiederholt sterben. HgCl2. Eine toxische und nicht-spezifischer Inhibitor der AQPs hemmte dramatisch of this ASL Volumen Antwort, obwohl of this Befund Durch apikal hinzugefügt HgCl im Widerspruch Zu Ihrer früheren Bericht Eines Deutlich milder (~ 30%) Reduktion der transepithelialen und Membranwasserdurchlässigkeit Erscheint2 (8). Basierend auf Daten Diesen schlugen die Autoren, sterben Dass Hemmung der Atemwegs AQPs Durch Amilorid für sterben klinische WIRKUNG berücksichtigt und Unterstützt sterben Hypothese ASL Dehydratisierung in CF.

Hier mit im Wesentlichen den same Atemwegsepithelzellen Zellkulturmodell von Donaldson used et al.. wir fanden keine wirkung von Amilorid auf transepithelial oder Plasmamembran osmotische Wasserdurchlässigkeit. Unsere fluoreszenzbasierten Methoden Waren in der Lage erfassung kleiner Wasserdurchlässigkeit von Differenzen lt; 10%. Auch fanden wir keine wirkung von Amilorid auf Wasserdurchlässigkeit Status der einzelnen Atemwege / Longe AQPs in transfizierten Epithelzellen oder in AQP5 abhängigen Luftraum-Kapillare Wasserdurchlässigkeit in intakten perfundierten Mauslunge sterben. Wir schließen daraus, that Amilorid hemmt nicht osmotisch angetriebene Wassertransport in der Atemwege oder der Lunge, Wodurch notwendigkeit angibt sterben, EINEN other Mechanismus zu identifizieren (s), um sterben paradoxe Klinischen Beobachtungen von Donaldson berichtet, zu erklären, et al. Die Diskrepanz between unsere speziellen Ergebnissen Sie und Denen von Donaldson et al. Können zu Unterschieden in der Messtechnik in Beziehung Gesetzt Werden, Wie oben erörtert. Die Techniken der Donaldson et al. (1) haben keinen Einfluss auf gerechnet wurden von Matsui beschäftigt et al. (8) bei der Charakterisierung von HBE Wasserpermeabilitäten. This Frühere Studie in Beiden nicht-CF und CF P1 Kulturen Eine Plasmamembran berichtet Pf (~ 90 mgr; m / s) ~ 2-fach Weniger als transepithelial Pf (~ 160 Mgr; m / s), Die Eine physikalische Unmöglichkeit Für einen dichten Epithel ist, Weil sterben apikalen und basolateralen Membranen Barrieren in Serie Sind. Hier Unsere Ergebnisse für P0 Kulturen sehr Unterschiedlich Sind, Eine Höhere Membran Pf (~ 200 mgr; m / s), der ~ 4-fach Grösser als transepithelialen Pf (~ 50 mgr; Frau). Für Nicht-CF und CF P1 Kulturen, fanden wir Eine untere transepithelial Pf (~ 25 mgr; Frau). Unsere ergebnisse stimmen mit den vorhergesagten Unteren transepithelialen Permeabilität Einer mehrlagigen Zellkultur.

Airspace-Kapillare Wasserdurchlässigkeit in perfundierten Mauslunge.EIN. Repräsentative Spuren von Pleuraoberfläche Fluoresceinisothiocyanat-Dextran-Fluoreszenz von Wildtyp-Maus ohne Longe (oben links ) Und mit (oben rechts ) 500 mgr; m Amilorid und aus unbehandelten Lungen von AQP5-null-Maus (Boden ). Lungenarterie Perfusat Osmolalität angezeigt. B. Zusammenfassung der Raten der Kapillar-Luftraum osmotisches Gleichgewicht von Experimenten, Wie für EIN. (Vier Mäuse / Zustand ± S. E.). Unterschied war nicht merkbar.

Ohne Bestätigte Hemmung der AQP-Funktion, bleibt es Schwierig, sterben berichteten schädlichen klinische WIRKUNG von Amilorid zu verstehen. Mehrere kleine Studien that unter Anderem Durch Donaldson et al. (1) Haben gezeigt, that Amilorid gezeigt, sterben Dass HS-vermittelten Akuten anstieg der mukoziliäre Räumungs nicht rückgängig machen. Zum beispiel in 16 Gesunden Probanden, Eine Einzeldosis von inhaliertem Amilorid plus 7% HS nicht zu Einer erhöhung oder zu verringern nicht mukoziliäre Räumungs im Vergleich zu 7% HS allein (27). There is einige Hinweise darauf, allein sterben inhaliert Amilorid vorschlagen, nicht mit HS gepaart, Kanns Eine positive mukoziliäre Räumungs Haben bei Gesunden WIRKUNG Auf die und CF Probanden (27 28). Es wird jedoch berichtet, that Amilorid nicht im Lungengewebe bleiben sollte lang genug erhebliche langfristige Auswirkungen auf sterben Lungenfunktion (29) Zu haben. Amilorid ist Bekannt Na + / H + -Austausch Hemmen, so ist es Möglich, Dass scheinbar sterben negativen Auswirkungen von Amilorid in Gegenwart Eines GROßEN hyperosmotischen einen other Ort Aktion bezogen (n) auf Epithelzellen der Atemwege Durch veränderung der Zell pH Regulierung oder Ionen Last -Gleichgewicht.

Stehen Immunolokalisation Studien Haben Expression von AQP4 an der basolateralen Membranoberfläche in Epithelzellen im Gesamten Grossen und kleinen Atemwege in Mausen, Ratten und Menschen (besprochen in Ref. 30) sterben berichteten. AQP3 Wurde in den basalen Zellen von Grossen und Mittleren Atemwege und nasopharnyx Eine begrenztere Expressionsmuster Haben in basolateralen Membranen gefunden. Mehrere Studien Haben Expression von AQP1 in mikrovaskulären Endothel Durch Atemwege / Lungen, Aber nicht in Epithelzellen sterben (31 32) gezeigt sterben. AQP5 ausgedrückt Wird stark in Art alveolaren I Epithelzellen bei Menschen und Nagetieren und wahrscheinlich in Einigen Epithelzellen der Atemwege in den Menschlichen Grossen Atemwege (32 33). In gut Primärkulturen von Menschlichen Epithelzellen der Atemwege und in Einer Festen Menschlichen Bronchien, fanden wir hier sterben Expression von AQP3 und AQP4 in den basolateralen Membranen der Atemwegsepithelien Aber nicht AQP5 Proteinexpression Erkennen differenzierten. Jedoch Spiegelt das fehlen von AQP5 Immunanfärbung wahrscheinlich EINEN Mangel ein Antikörperspezifität und nicht Abwesenheit von funktionellem Protein die, das Nachgewiesen Gegenwart von AQP5 in nasalen und bronchialen Epithelzellen in früheren Studien gegeben (33).

Vor Funktionelle Studien Haben Beteiligung von AQPs in Atemwegswasserdurchlässigkeit vorgeschlagen sterben. Unsere Ersten Messungen in microperfused kleinen Atemwege von Meerschweinchen zeigten Eine hohe transepithelialen Wasserdurchlässigkeit (Pf ~ 50 mgr; m / s), sterben schwach temperaturempfindlich und Krieg mercury-unempfindlich, war Beteiligung von AQP4 (7) Krieg sterben. Die Jüngsten Daten aus Sphäroid Explantat der Menschlichen Nasenpolypen lieferten Hinweise auf AQP5 Funktion in Atemwegsepithelien. In Diesen Grossen, kugelförmigen Atemwegszellmonolayern, mit der bewimpert Apikalmembran nach außen gewandte, Pederson et al. (9) berichtet Hohen Membran Pf (~ 150 mgr; m / s), sterben Niedriger KONZENTRATION mercury empfindlich auf kurze Exposition Krieg. Hier Unsere hohe Pf Werte für HBE Kulturen und der Schwachen Temperaturabhängigkeit der Permeabilität vorschlagen AQP-vermittelte Wasserbewegung (Abb. 2). In addition Wird sterben Reduzierte transepithelialen osmotischen Wasserdurchlässigkeit unter niedrigen pH-Wert in der basalen (Aber nicht apikal) -Membran Gerichtete Lösung leiht Kevin indirekten Beweis für Funktion der AQP3 (den einzigen pH-regulierten AtemWeg AQP) in HBE basolateralen Membranen (19) sterben. Die ZUGABE von HgCl2 hier führte zu den Kulturen in deutlichem leakiness mit reduzierter transepithelialen Widerstand used Wird, ausgeschlossen Schlussfolgerungen über HgCl2 Auswirkungen. CF Kulturen Hatten Ähnliche Wasserdurchlässigkeit auf nicht-CF Kulturen, im Einklang mit Unserer RT-PCR-Daten (Abb. 3C Und) mit früheren Berichten (8. 9).

Aus Theoretischen Grunden ist Funktion der sterben Atemwege AQPs keine Wesentliche Determinante der ASL Volumen, Zusammensetzung oder andere Eigenschaften zu Erwarten. Weil sterben Lipiddoppelschicht in Plasmamembranen erhebliche Wasserdurchlässigkeit Hut, erhöht das Vorhandensein von AQPs allgemein Plasmamembran der Wasserdurchlässigkeit von nur 5-10-fach, für Eine schnelle Flüssigkeitsbewegung, Wie in der Niere oder der Speicheldrüse von bedeutung ist, nicht Aber für sterben viele Größenordnungen Langsamer sterben Flüssigkeitsbewegung in der Lunge (in Ref überprüft. 34). Denn trotz 10-fache osmotische Wasserdurchlässigkeit in Mauslunge Durch Die Streichung von AQP1 und AQP5 verlangsamt, isosmolar Flüssigkeitsaufnahme Krieg nicht betroffen (20. 35). Auch wir BEREITS berichtet, sterben Dass Deletion von Jeder der Atemwege / Lungen Aquaporine (AQP1, AQP3, AQP4 und AQP5), einzeln und in Kombinationen, nicht ASL Volumen oder ionische Zusammensetzung beeinflussen und had Nur eine minimale WIRKUNG der Atemwegs Trink bei folgenden Grenzwerte Atemfrequenz ( 10).

Die obige Diskussion zeigt sterben Schwierigkeit Aquaporin-Funktion in zuschreibt und erhöhte ASL Volumen im Allgemeinen für sterben Auswirkungen der zerstäubten HS zu berücksichtigen. Ein weiteres mögliches Problem mit der Hypothese der erhöhten ASL Volumen ist that sterben überschüssige ende Flüssigkeit zu den intakten Atemwege hinzugefügt / Longe ist wahrscheinlich, Minuten oder Zehn Minuten zu zerstreuen über Anstätt Eine in ASL Volumen über Stunden between hypertonen Salz Behandlungen erhöht nachhaltig Produzieren. Aufgrund der grossen OBERFLÄCHE-zu-Volumen-Verhältnis der Alveolen und Atemwege und ihre hohe Wasserdurchlässigkeit, hinzugefügt Hypertonus ende Flüssigkeit Innerhalb von 1 min nahezu isotonisch Wird aufgrund des osmotischen Wasser ausströmen in sterben Lufträume. Wir zeigten schnelle osmotisches Gleichgewicht zunächst bei Schafen Longe (36) und später in anderen Säugetieren (18), einschließlich der Maus, Wie in Abb. (In. Ref überprüft 37) 6. Wegen der Raschen isosmolar Flüssigkeitsaufnahme in Säugetier Lunge, einschließlich der Lunge Menschlichen, die ~ 40 ml isosmolar ende Flüssigkeit Durch Vernebeln 5 ml 7% Hergestellt HS in absorbiert wahrscheinlich Werden soll lt; 15-30 min. Genaue Räumungs-Rate von HS Würde jedoch in kleinen auf Wadenfänger verteilung abhängen sterben gegen Grossen Atemwege Vernebelung folgen. Schnelle isosmolar Flüssigkeitsabsorption ist in der Longe Auch CF trotz Abwesenheit CFTR, Weil basalen cAMP-Unabhängigen Lungenflüssigkeitsabsorption ist nicht mit CFTR gezeigt Worden (38). SOMIT ist es Schwierig, den Klinischen Nutzen von HS with the erwarteten vorübergehenden anstieg in ASL Volumen in Einklang zu bringen; jedoch ist sterben Genaue Lage von überschüssiger ende Flüssigkeit, in BEZUG auf sterben Atemwege gegen Alveolen und periciliary gegen Schleim ende Flüssigkeit, ist nicht bekannt. Das erhöhte Volumen ASL Mechanismus würde auch ein besseres Plan Ergebnis vorherzusagen, zum Inhalieren nicht absorbierten gelösten Stoffe, Wie Mannit oder Xylit, sterben aus Klinischen Studien nicht der Fall ist (5).

Alternative Mechanismen gerechnet wurden für sterben scheinbare Klinischen Nutzen zu berücksichtigen inhalierter hyperosmolar Mittel vorgeschlagen. Ein Mechanismus Beinhaltet sterben DIREKTE WIRKUNG von NaCl und Mannit auf Schleims Rheologie (5). HS Wurde Durch Abschirmung Festen negativen Ladungen Auf dem Mucin Rückgrat Mucin-Verstrickung zu reduzieren vorgeschlagen; Mannit Wurde mit oligopolysaccharides auf Mucin-Makromoleküle, Wodurch stören Wasserstoffbrückenbindungen und Verringerung der Verwicklungen (39 -41) zu konkurrieren vorgeschlagen sterben. Ein vorgeschlagener Mechanismus zum Nutzen Mannit auf der Hypothese basiert, that Eine Relativ- salzigen ASL in CF angeborenen Immunabwehr abnimmt, Wie Lysozym, Lactoferrin, und β-Defensinen. If richtig ist, ein nicht-ionisches osmotische Mittel, Wie Mannit Könnte von vorteil sein, Durch ASL Salzkonzentration zu reduzieren (5. 25. 42). Ein further vorgeschlagener Mechanismus ist Induktions von Husten bei Patienten hyperosmolar Mittel inhaliert sterben, Atemwege sehr irritierend Sind, obwohl einige Studien kommen zum Schluss, Dass Veränderungen in der mukoziliäre Räumungs Werden Kaum erhöhten Husten zurückzuführen ist (3. 4. 22) in sterben sterben. Eine weitere vorgeschlagene Mechanismus Beinhaltet sterben DIREKTE oder indirekte Einwirkung von hyperosmotischem Agenten auf Schleim-sezernierenden Zellen oder sensorischen Nerven zu stimulieren Schleimabsonderung, Wodurch erhöhte Schleimabsonderung und Ciliar- Aktion vorgeschlagen zu «spülen» sticky, Bakterien beladene Sekrete (5). Wir wurden sterben möglichkeit Einer vorübergehenden osmotischen strömungsinduzierten Konvektion von Schleim in sterben Atemwege als ein Wichtiger Faktor in der Klinischen Nutzen von HS zu of this Liste hinzuzufügen. Eine kritische Überprüfung des Mechanismus (n), with the HS Lungenfunktion bei Mukoviszidose verbessert Könnte zur inhalativen osmolare Therapie zu Einems Besseren, Mechanismus-basierter Ansatz Führen.

Anerkennungen

Wir danken Lorna Zlock und Jean Davidson für Kulturen von Menschlichen Atemwegsepithelien Vorbereitung, Dr. Michael Matthay für Unterstützung bei der Akquisition von Lungenproben, Dr. Dan Zhao sterben für die Hilfe bei der RT-PCR-Analyse, Dr. Yaunlin Lied für Technische Beratung bezüglich Mauslunge Perfusions und Liman Qian für Maus Zucht und Genotyp-Analyse.

Fußnoten

↵ 3 Die verwendeten Abkürzungen Sind: CF, Mukoviszidose; CFTR, CF Transmembran Regulator; ASL, Atemwegsflüssigkeit; AQP, Aquaporin; FRT, Fisher Ratte Schilddrüse; RT, reverse Transkription; PBS, Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung; HBE, Menschlichen Epithelzellen bronchialen; MES, 4-Morpholinethansulfonsäure; HS, hypertonische Salzlösung; ENaC, epithelialen Natriumkanals.

↵ * Diese Arbeit Würde von der National Institutes of Health Grants HL59198, HL73856, DK35124, EB00415 und EY13574, Mukoviszidose Forschung und translationale Kernzentrum Grants DK72517 und Forschung Development Program Zuschuss von der Cystic Fibrosis Foundation Unterstützt. Die Kosten der VERÖFFENTLICHUNG of this article gerechnet wurden Teilweise Durch Die Zahlung von Gebühren Seite bestritten. Dieser Artikel Muss DAHER hiermit Westerwaldkreis.png werden «Werbung «Nach 18 U.S.C. § 1734 allein this tatsache anzuzeigen.

↵ 1 Unterstützt von Einems National Institutes of Health Medical Scientist Ausbildung Grant.

  • Empfangene 5. Mai 2006.
  • Revision Erhielt 5. Juli 2006.
  • Die amerikanische Gesellschaft für Biochemie und Molekularbiologie, Inc.

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